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     不同的细胞，喜欢的环境是不一样的   这个不仅仅是说培养基的不同，还有就是细胞生长的空间密度问题。有些细胞有密度依赖性，数量多一点时比较好生长，生长状态也比较好，这种一般是属于生长速度慢的细胞，譬如内皮细胞。而有一些是细胞是数量少一点细胞状态会生长的比较好，譬如巨噬细胞和某些肿瘤细胞，尤其是巨噬细胞，生长速度非常得快，贴壁速度很快，所以传代时就应该留很少量的细胞，这样细胞状态会比较好。并且，巨噬细胞比较喜欢扎堆生长，而堆与堆之间是有空间的，如果长成相连在一起的一满片的时候，细胞形态基本上就会差了，老化的会比较多，对后期实验结果不好。所以在养细胞的时候应该摸索该细胞喜欢的生长空间密度问题。

细胞形态不好或状态差怎么办？

      对于贴壁细胞，如果细胞形态不好，（或者细胞形态不清晰，表面似有异物等）可以在传代的时候进行如下操作：

首先，倒掉旧的培养基，加入3ml PBS洗涤一次，用滴管吸走，然后再加入3ml的 PBS进行预吹打，控制吹打力度，轻轻地大概沿着瓶底过一遍，然后吸走。这时候再开始正式的消化、吹打。

      其次，把吹打下来的细胞悬液加入到新的培养瓶内，培养瓶事先加入培养基，放入培养箱内培养，按时间点观察细胞贴壁情况。10分钟观察一次，20分钟，30分钟观察一次。选择一个时间点，已经有部分细胞贴壁的情况下，重新置于洁净台，底面朝上迅速倒出其中的培养基，加入3ml新培养基再轻轻洗一次。然后，加入完全培养基培养。后续观察细胞生长情况以及形态，如果一次效果还不理想，可重复多次。直到找到细胞完美形态。其中要注意结合细胞喜欢的生长情况,对于有密度依赖性的细胞，等贴壁细胞比较多点的时候再传传代，反之亦然。对于悬浮细胞，如果细胞培养过程中有较多死细胞或细胞碎片，可将细胞吹散后用离心管收集离心，离心后沉淀分为两层，活细胞处于上层，死细胞和细胞碎片处于下层，呈白色。去上清，加入新鲜培养基将上层细胞轻轻吹打混匀（不要用力过猛，从而将细胞碎片吹散），再将细胞悬液接种至新的培养瓶，放入培养箱继续培养。

       细胞传代消化的问题 可以这样说，对于需要消化传代的细胞，每一次消化都是对这个细胞存活与否、状态好与不好的至关重要的考验。我们经常会遇到这样的问题，自己培养的细胞开始几代生长状态良好，可是传代几次之后细胞状态就不行了，越来越差。对于这个问题，可以非常肯定地说，细胞消化环节出问题了，每一次消化都让细胞受到较大损伤，所以越长越差。

在消化的过程中，加入胰酶后，所有细胞都在被胰酶消化着，但是每个细胞的生长状态是不一样的，细胞的贴壁情况也是不一样的，有的贴壁牢固，有的贴壁较松，这一点往往容易被忽视。对于较难消化或对胰酶敏感的细胞，可以采用四步消化法，具体操作如下：

第一步：不加胰酶，倒掉旧培养基加入少量新培养基洗1-2遍，（这是前奏，目的是将漂浮着的死细胞之类尽量洗掉。

第二步：加入少量新培养基直接吹打一遍，把贴壁不牢固的细胞吹打下来，再用培养基清洗一遍，两次所得悬液混合传入新瓶。（可以将这些传入新瓶培养，与后面胰酶消化过的细胞生长状态进行对比观察即可知道该细胞对胰酶的敏感度。）

第三步：吸干净瓶内剩余液体，加入2mlPBS润洗一遍，吸掉弃之，再加入1ml左右的胰酶消化。消化的同时置于显微镜下观察，待细胞与细胞之间间隙明显的时候立即吸掉胰酶于干净EP管备用，加入新培养基吹打2-3遍后吸取悬液于离心管或新瓶暂存。用2ml左右新培养基洗一遍与前面的混合（也可以传入新瓶培养，以便与后面及前面的做对比）。

第四步：把第三步吸出来的胰酶重新加入瓶内，继续消化剩余的贴壁牢固的细胞（也可以用新的胰酶），继续镜下观察，待剩余细胞间隙明显，细胞独立开来的时候，吸掉胰酶，加入新培养基吹打，悬液传入新瓶培养。

将细胞消化分成这几步，除了是为了避免胰酶对细胞的损伤之外，还有一个更重要的作用就是，可以最大程度地把细胞吹打成单个单个的状态，不成片不连体。